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此前，CRISPR/Cas介導的植物基因組定點敲除技術(shù)只能在基因組特定位點產(chǎn)生隨機插入和刪除，精準的片段插入和替換的效率一直很低，極大地限制了其在植物研究和育種上的應用。因此，迫切需要建立更高效的植物基因組片段插入和替換技術(shù)體系。
朱健康研究組通過嘗試，發(fā)現(xiàn)將供體片段同時進行硫代修飾和磷酸化修飾后，能極大地增強CRISPR/Cas9引導的靶向敲入效率。研究團隊先后在14個基因位點上成功靶向敲入了各類調(diào)控元件，包括翻譯增強子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，甚至整個啟動子，供體片段最長達2049bp。通過對1393株各類T0代基因編輯水稻植株的分析發(fā)現(xiàn)，該方法的敲入效率可高達47.3%，平均效率為25%。如此高的敲入效率甚至可以同時在四個位點上實現(xiàn)多基因靶向敲入。
研究人員預計，該技術(shù)的建立將使靶向敲入成為一項和靶向敲除一樣的常規(guī)實驗，被各個植物研究和育種單位廣泛應用。
同時，研究人員又巧妙地設(shè)計了一種片段精準替換的策略，稱之為重復片段介導的同源重組（TR-HDR）方法。常規(guī)的HDR頻率極其低下，但他們在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)，基因組上串聯(lián)重復片段間的HDR頻率非常高。他們利用這一現(xiàn)象，通過將修飾的片段靶向敲入目標位點，人為制造這種串聯(lián)重復結(jié)構(gòu)，誘導TR-HDR去實現(xiàn)片段替換。采用該技術(shù)，他們在五個基因位點上實現(xiàn)了片段替換和原位的Flag標簽蛋白的精準融合，效率最高達到了11.4%。這一技術(shù)突破將有助于植物學研究，并促進農(nóng)作物定向遺傳改良的進程。（岳陽）
中國科學報
